4 Österreicher/innen maßgeblich an der Entwicklung und Erprobung einer neuen Methode der Gen-Analyse beteiligt

Quantensprung in der DNA-Analyse: DHPLC ist genauso sicher wie der Goldstandard der Gen-Analyse, aber vielfach schneller und billiger

Wien (OTS) - Eine topaktuelle Studie der Wiener Wissenschaftlerin Univ.-Prof. Dr. Teresa Wagner beweist es: DHPLC ist als Analysemethode genauso treffsicher beim Auffinden von Genmutationen wie der derzeitige "Goldstandard" der Genanalyse, das direkte Sequenzieren. DHPLC arbeitet aber über 100 Mal schneller und verursacht nur einen Bruchteil der Kosten des direkten Sequenzierens. Nun können auch kleinere Krankenhäuser und Labors krankmachende Genmutationen bei Patient/inn/en feststellen und diese gegebenenfalls in engmaschige Vorsorgeprogramme integrieren.

Ab 3. Oktober 2000 Jahrestagung der amerikanischen Gesellschaft für Humangenetik in Philadelphia

Anlässlich der Jahrestagung der amerikanischen Gesellschaft für Humangenetik in Philadelphia - der weltweit renommiertesten Tagung in diesem Feld - präsentiert Univ.-Prof. Dr. Teresa Wagner, Leiterin der Forschungsgruppe für erblichen Brust- und Eierstockkrebs an der Abteilung für Spezielle Gynäkologie, AKH Wien, am 3. Oktober 2000 die Ergebnisse ihrer topaktuellen Studie zur DNA-Analyse: Im Rahmen einer internationalen Untersuchung des Breast Cancer Information Core (BIC) wurde am Beispiel des Brustkrebsgens BRCA 1 die Eignung der Methode DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) für die Auffindung von Genmutationen überprüft.

Mit DHPLC ist es Prof. Wagner gelungen, alle Genmutationen aufzuspüren

Die Ergebnisse wurden mit der Methode des direkten Sequenzierens verglichen, die etwa das milliardenschwere Unternehmen Celera (Präsident: J. Craig Venter) verwendet. Celera befindet sich in einem Wettlauf mit dem Human Genome Project um die Entschlüsselung des menschlichen Gencodes. Das Ergebnis: Mit DHPLC wurden ebenso wie beim Sequenzieren alle DNA-Mutationen der zu untersuchenden 65 Personen aufgespürt, allerdings arbeitet DHPLC über 100 mal schneller und verursacht nur ca. 1/7 der Anschaffungskosten (und 1/4 der Durchführungskosten) des direkten Sequenzierens. Für die Genforschung bedeutet das einen Quantensprung, denn von nun an werden nicht mehr ausschließlich die weltweit größten Labors und Kliniken ihren Patient/inn/en eine sichere Methode der DNA-Analyse anbieten können.

3 Tiroler haben mit der Entwicklung einer neuen Messsäule den entscheidenden Impuls bei DHPLC geleistet

Das erste Mal kam Prof. Wagner 1995 mit dem neuen Verfahren in Berührung: "Wir waren damals verzweifelt, weil wir wussten, dass wir uns die Methode des direkten Sequenzierens nicht leisten konnten, alle anderen Verfahren aber nicht unseren Standards der Sicherheit und Genauigkeit entsprachen." Bei einem Vortrag lernte Prof. Wagner dann einen der "Väter von DHPLC", den Tiroler Univ.-Prof. Dr. Peter Oefner, kennen. Dieser hatte gemeinsam mit seinem Tiroler Kollegen, Univ.-Prof. Dr. Christian Huber, unter der Federführung von Univ.-Prof. Dr. Günther Bonn (Vorstand des Instituts für Analytische Chemie und Radiochemie an der Universität) das größte Problem der bereits seit längerem bekannten Methode HPCL (High-Performance Liquid Chromatography) gelöst: dass Silikat, jener Bestandteil in der Messsäule, der über Genmutationen Auskunft geben sollte, nach wenigen Versuchsreihen die DNA bindet und das Gerät darauf hin nicht mehr verwendet werden kann.

Bonn, Oefner, Huber und Transgenomic halten die Patente auf die neu entwickelte Säule

Bonn, Oefner und Huber erkannten als Erste, dass man dieses Problem umgehen kann, indem man anstelle des Silikats spezielle Plastikkügelchen - sogenannte "Polystyrene beads" - verwendet, die mittels spezifischer Techniken gepresst und gebacken werden, bis sie eine einheitliche Masse ergeben. Oefner wurde vom Chemieprofessor Ron Davis nach Stanford geholt, wo er heute als Vizedirektor am Stanford Genome Technology Center fungiert, und ließ dort gemeinsam mit seinen Tiroler Kollegen und dem amerikanischen Unternehmen Transgenomic die neu entwickelte Säule als WAVE(R) System lizensieren.

Die Abteilung für Spezielle Gynäkologie war die erste Abteilung in Europa, an die Geräte zur Anwendung von DHPLC geliefert wurden

Nach der Kontaktaufnahme zwischen Teresa Wagner und Peter Oefner erklärte sich dieser bereit, DHPLC am Beispiel des Brustkrebsgens BRCA 1 auszuprobieren. Eine Mitarbeiterin des Teams um Prof. Wag-ner, die medizinischtechnische Analytikerin Daniela Muhr, verbrachte darauf hin drei Wochen in Stanford bei Prof. Oefner, um mehr als 4.000 DNA-Proben zu testen. "Das Gerät war zu diesem Zeitpunkt nur in Einzelteilen lieferbar. Die gesamte Technologie steckte noch in den Kinderschuhen und es gab keinen technischen Support für den Einsatz von DHPLC", erklärt Prof. Wagner die Schwierigkeiten, mit denen ihr Team damals konfrontiert war. Dennoch war die Abteilung für Spezielle Gynäkologie die erste innerhalb Europas, an die ein derartiges Gerät geliefert wurde. (Mittlerweile verfügt die Abteilung bereits über drei DHPLC-Geräte.)

Wie funktioniert DHPLC?

DHPLC: Genmutationen werden durch Schmelzverhalten der DNA sichtbar

Grundsätzlich leistet DHPLC dasselbe wie das direkte Sequenzieren, d.h. DNA-Stücke werden auf Veränderungen / Mutationen analysiert. Im Unterschied zur Sequenzierungs-Methode werden die Basenpaare aber nicht mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert und mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt, um auf dieser Basis Kurven zu zeichnen, sondern es wird das Schmelzverhalten der DNA analysiert. Durch den Schmelzvorgang werden sogenannte "mis-matches" sichtbar, da Basenpaare, die auf Grund von Veränderungen nicht zusammengehören und daher eine schwächere Bindung aufweisen, früher als normale Konstellationen schmelzen, was die Säule (von Bonn / Oefner / Huber) aufzeigt.

Die DNA-Teile werden "kopiert", denaturiert und wieder renaturiert, unter Hochdruck auf einer Trägerflüssigkeit durch das Gerät geschleust und im Hinblick auf ihr Schmelzverhalten analysiert

Im Detail funktioniert das DHPLC Verfahren folgendermaßen: Nach der Blutabnahme wird eine sogenannte "polymerase Kettenreaktion" (PCR - polymerase chain reaction) eingeleitet - ein Verfahren, mit dem das zu analysierende DNA-Stück 1.000.000fach "kopiert" wird, um eine ausreichende Menge für die Analyse bereit zu stellen. BRCA 1 besteht aus rund 10.000 Basenpaaren (BRCA 2, das zweite Brustkrebsgen, sogar aus über 15.000), diese werden nach heutigem Stand der Forschung in 35 (bzw. 46 bei BRCA 2) "Amplikons" (Analyseeinheiten) zerlegt. Die Aufteilung der DNA-Stränge erfolgt im Temperaturbereich von 52 Grad C bis 62 Grad C (= Denaturieren). Die DNA-Teile selbst werden mit Hochdruck (High-Performance) auf einer Trägerflüssigkeit (Liquid) durch das Gerät geschleust, und auf der Säule wird das Schmelzverhalten gemessen. Die daraus resultierenden Kurven (Chromatogramme) lassen sich leicht analysieren und zeigen auf, ob Veränderungen vorliegen oder nicht.

Vorteile von DHPLC

Die große Sensation des Verfahrens ist die geringe Zeiterfordernis für die Auswertung der Messergebnisse. Während die Analyse von BRCA 1 mittels direktem Sequenzieren drei Arbeitstage a 8 Stunden erfordert, gelingt diese mittels DHPLC innerhalb von 13 Minuten!

Vergleich:
1) Sequenzieren
2) DHPLC:

Analyseergebnis: idente Qualität

Zeit:
1) 3 Arbeitstage
2) 13 Minuten!

Arbeitskosten:
1):2) ca. 111:1

Investitionen:
1) D 700.000
2) D 95.000

Materialkosten: pro Patient/in
1) D 200
2) D 50

Hinsichtlich der Kosten muss man bei den Sequenzierungs-Hochleistungsgeräten (analysieren 96 Proben gleichzeitig innerhalb weniger Stunden), rund 350.000 USD kalkulieren, plus weiterer 350.000 USD für die Software zur Auswertung der Datenmengen. Dagegen kostet das Gerät für die Anwendung des DHPLC-Verfahrens in Europa lediglich 95.000 USD; eine spezielle Software ist für die einfach zu lesenden Chromatogramme nicht erforderlich. Pro Patient/in kommen bei DHPLC 50 USD an Materialkosten hinzu, gegenüber 200 USD beim direkten Sequenzieren. (Nicht eingerechnet sind die Arbeitskosten, die auf Grund der wesentlich geringeren Analysezeiten bei DHPLC massiv ins Gewicht fallen.)

Geringere Datenmengen ermöglichen einfache Analyse

Bei identer Analysesicherheit ist die Auswertung mit DHPLC wesentlich einfacher: Die Chromatogramme müssen lediglich übereinandergelegt werden und die Mutationen werden sofort sichtbar. Dagegen müssen beim direkten Sequenzieren die Basenpaare einzeln mit einander verglichen werden.

Wenige Analyseschritte, daher optimale Reproduzierbarkeit

Ein weiterer großer Vorteil der Methode besteht in ihrer Einfachheit, die eine optimale Reproduzierbarkeit ermöglicht. Je weniger Schritte bei einem Verfahren notwendig sind, umso geringer ist die Gefahr, dass sich unkontrollierbare Störvariablen einschleichen.

Für wen ist DHPLC geeignet?

Mit DHPLC können alle Arten von Genen auf krankmachende Mutationen überprüft werden

DHPLC ist für alle Labors und Kliniken geeignet, die ihren Patient/inn/en eine gute und sichere Methode der DNA-Analyse anbieten wollen, um einzelne DNA-Teile auf krankmachende Veränderungen zu überprüfen. Die Methode ist für alle Analysebereiche geeignet, von der pränatalen Diagnostik angefangen, über postnatales Screening (zystische Fibrose, etc.) und den gesamten Bereich der adulten Erkrankungen bis hin zur Forschung.

Was bedeutet DHPLC für die Patient/inn/en?

Schnelle Analysemöglichkeit bei Verdacht auf Gendefekte und engmaschige Vorsorgeprogramme für Hochrisikopatient/inn/en

Nur die Identifikation von Hochrisikopatient/inn/en ermöglicht es, diese in engmaschige Vorsorgeprogramme zu integrieren und ihnen frühzeitig die bestmöglichen Therapie- und Behandlungsprogramme anzubieten.

Beispiel: Ohne DHPLC wäre in Österreich nur ein Zehntel der Hochrisikopatient/inn/en bekannt

Für die Patient/inn/en werden auf diese Weise zunehmend Möglichkeiten der DNA-Analyse zur Verfügung stehen. In Österreich wäre ohne die Methode maximal ein Zehntel der bis jetzt identifizierten 71 "Mutationsfamilien" bekannt. Auch in Deutschland arbeiten alle zwölf Brustkrebs-Genanalyse-Forschungszentren, in denen DNA-Analysen durch-geführt werden, mit DHPLC.

Das Team

Das Team von Prof. Wagner
Das Team um Prof. Teresa Wagner und Prof. Peter Oefner setzt sich aus der Universitätsassistentin Dr. Regina Möslinger-Gehmayr, den medizinisch-technischen Analytikerinnen, Daniela Muhr, Michaela Hareter und Petra Kofler, sowie den Psychologinnen Mag. Gudrun Langbauer und Dr. Gabriela Traun-Vogt zusammen.

Breast Cancer Information Core

Das Breast Cancer Information Core sammelt weltweit Mutationen in Brustkrebsfamilien

Das Breast Cancer Information Core ist eine internationale Vereinigung von US- und europäischen Expert/inn/en, die weltweit Mutationen in Brustkrebsfamilien sammelt. Prof. Wagner ist Vorstandsmitglied dieser Vereinigung. Die vergleichende Untersuchung zwischen DHPLC und dem direkten Sequenzieren sollte klären, wie sicher krankheitsassoziierte Mutationen mit diesen Methoden erkannt werden können.

Transgenomic
Transgenomic - börsennotiertes Unternehmen im Bereich Gentechnologie

Transgenomic, Inc. (San Jose, Kalifornien / Omaha, Nebraska) vertreibt innovative Forschungsgeräte und -methoden für die Gentechnik-Industrie, um die Diagnostik und Entwicklung neuer Medikamente voranzutreiben. Die großen Forschungs- und Entwicklungszentren befinden sich in Kalifornien und Großbritannien. Die biotechnologischen Erkenntnisse im Bereich Gen-Analyse werden von Forschungseinrichtungen weltweit eingesetzt. Seit 18. Juli 2000 ist das Unternehmen mit 5,152.000 Anteilen unter dem Symbol TBIO an der NASDAQ börsennotiert. Das Wave System wurde erstmals 1997 auf den Markt gebracht.

Internet-Adresse: http://www.transgenomic.com

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